1849年，巴甫洛夫出生在俄羅斯梁贊城一個貧窮的牧師家庭，父親是個傳教士。他從小在教會學校讀書，依照傳統習慣，他本應接過父親的衣缽，當一名牧師。但是，巴甫洛夫拋棄了宗教留給他的前途，1870年，21歲的巴甫洛夫帶著一張“貧困證明書”，進入了彼得堡大學攻讀生理學專業。
在大學學習期間，巴甫洛夫實際上就已經開始了對循環生理學、消化生理學和大腦生理學的研究。1875年大學畢業時因學習成績優秀，獲得金質獎章。不久，他轉入軍醫學院繼續深造。為了充實自己關於人體生理和病理學的知識，巴甫洛夫到外科醫學研究院學習了一年，接著又到國外留學兩年。
後來，巴甫洛夫又轉到軍醫學院深造，並在這所學院中度過了40多個年頭。期間，巴甫洛夫選擇了研究消化系統的生理狀況這個課題，開始長時間觀察動物體內的消化活動。
因為科學事業是不被當時的政府所關心，所以巴甫洛夫的研究沒有得到任何的支持，連家庭生活也陷於極度的貧困之中。
有一次，朋友看到他的日子過得很困難，就湊了一點錢，囑咐他給自己和孩子們添置幾件過冬的棉衣，可他卻把錢拿去買了幾隻狗。在巴甫洛夫看來，狗更重要，因為狗是他進行實驗所不可缺少的。他的工資微薄，為了買狗並供給飼料，他常常弄得不剩一文，甚至冬天買不起烤火的劈柴，有時連照明的燈油也買不起。
他的付出是有回報的，在經過長時間的研究之後，他創造了一種觀察胃腺活動的新方法，即後來聞名世界的“假飼”實驗。
他首先把狗的食道經過手術切斷，把切斷的食道兩端縫在狗脖子的皮膚上，然後讓狗餓上一段時間。然後再在狗面前的食盤裡放進鮮肉，狗一見鮮肉，便貪饞地吞了起來，可是它吃進去的肉很快又掉到食盤裡。這是因為狗的食道已被切斷，肉根本進不了胃裡。狗還是津津有味地吃著，可是始終沒有把肉送到胃裡，盤子裡的肉也始終保持不變。
同時，在狗肚子底下，拖著一根細細的橡皮管，這是因為狗的胃也被動了手術，在它裡面已經插入一根瘺管通到體外。有趣的現象出現了：當這隻狗徒勞地吃了四五分鐘後，橡皮管里流出了大量的胃液。因為這隻狗的胃是空的，所以這種胃液中沒有食物渣滓。狗不停地吃著，胃液一滴一滴不停地流，不久就淌滿了一個量筒。
胃液的分泌是狗的第十對腦神經——迷走神經的衝動引起的。巴甫洛夫對這隻狗的迷走神經也動過手術，已在上面引出一根絲線。現在，只要他稍微提動一下絲線，就切斷了大腦與胃之間的聯繫。結果是儘管狗還是不斷地吞咽鮮肉，但胃液卻停止分泌了。這就是著名的“假飼”實驗，它可以使人們觀察到狗的消化腺的分泌情況。
在此基礎上，巴甫洛夫又開始研究高級神經活動，第一次發現了大腦皮層機能的活動規律。